色谱分析过程中流速造成的影响?

色谱分析过程中流速造成的影响?
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    huihui0830

    【摘要】    通过不同长度n/(n-1) 系列和同长n系列寡核苷酸样品在柱温25 ℃~45 ℃和流速0.3~0.7 mL/min条件下分离度的变化趋势,研究了离子对色谱法中温度、流速对不同性质寡核苷酸模拟样品保留和分离的影响特点。结果显示:n/(n-1) 系列样品的分离度随柱温增加逐渐增大; n系列3组样品则呈现增加、减小和基本不变3种趋势,其中长度相同、碱基组成相同的寡核苷酸样品随温度增加,分离度几乎线性下降。温度并非仅通过影响寡核苷酸分子的传质来改变分离,还可能通过影响不同序列的空间结构改变碱基的空间容量。两系列样品均在流速0.4 mL/min获得最大分离,相对较低的流速可提高寡核苷酸样品的传质,有利于分离,在优化流速的同时应考虑流速改变对梯度洗脱中有机溶剂比例变化率的影响。

    【关键词】  寡核苷酸 反相离子对色谱法 流动相流速 色谱柱温度

      1  引言
       
      随着寡核苷酸合成技术的发展和成本的下降,合成寡核苷酸在基因分析、疾病诊断、核酸测序以及反义治疗等诸多领域的应用日益广泛[1~4]。尤其是反义核酸药物的研发为治疗病毒感染和肿瘤等疾病开辟了一个新的有效途径[5,6]。在各种寡核苷酸样品的分离纯化和分析应用中常用的分析技术有聚丙烯酰胺凝胶电泳 [7]、阴离子交换色谱 [8,9]、毛细管凝胶电泳 [10,11]和反相高效液相色谱 [12,13]等。反相离子对色谱法(RPIPC, reversedphase ionpair chromatography)作为一种重要的液相色谱分离模式,因具有反相色谱和离子交换等多种保留机理,可从失败的短序列中分离纯化合成的目标序列,产物纯度达95%以上[14,15],在一定条件下还可识别同长异列的寡核苷酸异构体或同长同列的修饰物[16,17]。目前已有研究工作将该法与质谱联用进行反义核酸药物的临床研究 [18]。
       
      合成寡核苷酸因应用领域不同,性质上有很大差别。但从分析的角度看,主要可分为两类:不同长度样品和同长异列样品的分离。在寡核苷酸的IPC分析中,柱温和流速是两个重要的影响因素。Gilar等[19] 认为温度作为影响生物大分子传质速率的重要因素,可通过影响柱效改变分离,这个结论成为高温下分离寡核苷酸的重要依据[19~21]。但温度的影响可能会因样品的性质产生差异。而大分子在液相色谱中不同于小分子的保留特点,使流速对色谱行为的影响较为显著,至今鲜有关于不同特征寡核苷酸样品的IPC分析中受流速影响特点的研究报道。因此,本实验在已报道的反向寡核苷酸异构体的IPC研究[22]基础上,对不同性质寡核苷酸样品受温度和流速的影响进行研究。根据研究需要本实验设计了不同长度n/(n-1)系列和同长n系列的6个共6组寡核苷酸模拟样品。

      2  实验部分

      2.1  仪器及试剂
       
      岛津液相色谱仪(SCL10AVP system controller/SPDM10AVP Diode array detector/LC10ADVP pump/DGU12A degasser/CLASSVP work station);色谱柱(YMC,Japan, AQC18,150 mm×4.6 mm i.d.,3 μm)。乙腈(ACN,TEDIA COMPANY,INC);三乙胺(TEA,北京益利精细化学品有限公司); 冰醋酸(AA,南京化学试剂有限公司);重蒸水(自制)。色谱条件见图注。

      2.2  实验用样品的设计、合成和纯化
       
      各种用途寡核苷酸样品的典型长度是约20个碱基[23]。根据常用样品的长度和碱基组成比例,设计了表1中的6个寡核苷酸模拟样品,由上海博亚生物技术有限公司合成,序列经PAGE纯化,纯度达95%以上。

      表1  实验用寡核苷酸(略)

      Table 1  Oligonucleotides used in this study

      根据序列的长度和碱基组成,表1中的样品分为以下两个系列:
       
      n/(n-1) 系列: 19mer/20mer1; 20mer1/21mer; 21mer/22mer。该系列碱基组成相似,长度相差1个碱基。
       
      n系列: 20mer1/20mer2; 20mer1/20mer3; 20mer2/20mer3。该系列的3个序列均为20个碱基,碱基组成相似,其中20mer2和 20mer3具有完全相同的碱基组成,但序列不同,20mer2的强疏水性碱基胸腺嘧啶(T)在序列的中间(No.12, 3′→5′);而20mer3的胸腺嘧啶在序列的3′末端。20mer1与上述两个序列相比,在相应位置上均为弱疏水性碱基胞嘧啶(C)。
       
      2.3  混合样品的制备  
       
      取19mer和20mer1样品各1 O.D.,用500 μL注射用水溶解并充分涡旋混匀,分别吸取上述溶液各50 μL混匀,即得。其它混合样品的制备方法同上。

      2.4  缓冲溶液的配制  
       
      将约2.21 mL冰醋酸溶解在约800 mL重蒸水中,混匀后缓慢加入约5.58 mL三乙胺,搅拌均匀后,用冰醋酸和三乙胺调节该溶液至pH 6.8,即得0.05 mol/L醋酸三乙胺(TEAA)缓冲溶液(pH 6.8)。

      3  结果及讨论

      3.1  柱温的影响
       
      本实验结合固定相的温度耐受性(YMCAQC18的最高耐受温度为50 ℃),分别考察了25~45 ℃柱温的影响(见图1)。结果显示,两个不同系列的分离度随柱温的变化呈现出不同的影响特点。
       
      图1  柱温对n/(n-1)(A)系列和n(B)系列寡核苷酸分离度的影响(略)

      Fig.1  Effect of temperature on resolution of n/(n-1)(A ) and n(B) oligonucleotides

      1. 19mer/20mer1; 2. 20mer1/21mer; 3. 21mer/22mer; 4. 20mer1/20mer2;5. 20mer1/20mer3; 6. 20mer2/20mer3。

      色谱条件(conditions): 流速(flow rate) 0.4 mL/min; pH=6.8; 流动相(mobile phase) A: 0.05 mol/L TEAA(acetic acid + triethylamine), 流动相(mobile phase) B:100% ACN。  25 ℃: 12.2% B~ 25%B, 0.52 % B/min; 30 ℃: 12% B~25% B, 0.53% B/min; 35 ℃: 11.8% B~25% B, 0.55% B/min; 40 ℃: 11.3% B ~25% B, 0.58% B/min; 45 ℃: 11% B~ 25% B, 0.60% B/min; 检测波长(detection wavelength): 260 nm。

      图1A中n/(n-1) 系列3组样品的分离度总体随温度的升高而增大。在45 ℃条件下,实现较好分离。在IPC保留过程中,n/(n-1)系列样品除了疏水性差异外,分子大小和电荷密度也有不同,保留行为差别较大。3组序列末端碱基特征几乎相同,但随着碱基数目的增加,实现单碱基识别的难度在不断加大(根据室温下3组序列分离度的变化特点),且随着序列长度的增加,温度对分离度的贡献也在增加。 因此,对于碱基数目较大、以长度差异为主要特征的寡核苷酸序列,增加温度是改善分离的有效手段。
       
      图1B中n系列样品的分离度受温度的影响与n/(n-1)系列有较大不同,产生了3种变化趋势: R20mer1/20mer2随温度的升高而增大; R20mer2/20mer3随温度的升高几乎线性减小;而R20mer1/20mer3受温度的影响较小。对比20mer2和20mer3两个序列,唯一的差异是T在序列中的位置不同。从保留时间(t20mer2=12.395 min, t20mer3= 13.515 min,25 ℃)上可以看出,T处于序列中间位置,对保留的贡献小于末端,而这种差异随温度的升高几乎线性减小;20mer1和20mer3的序列差异不仅有碱基T的位置差异,还有碱基组成的不同,两个序列的分离度随柱温升高呈现的微小波动,说明温度对T处于序列末端位置影响不大;20mer1和20mer2的差异主要来自序列的中间,T处在序列中间位置使得两序列的分离度随温度的升高而加大。对比R20mer1/20mer2和R20mer1/20mer3受温度影响的变化趋势,可以初步推断,柱温增加,R20mer1/20mer2增大主要由于20mer2在不同温度下序列中碱基T空间容量的差异,也正是这个差异使R20mer2/20mer3随温度的升高快速下降。结果表明温度对寡核苷酸类样品分离度的影响不仅仅来自大分子的传质,还通过其它方式影响分离,而且这种方式对同长异列寡核苷酸有重要影响。n系列产生的3种变化趋势,其原因可能是温度影响了序列的空间结构,导致碱基空间容量的变化。
       
      由20mer2和20mer3的保留时间可知,在寡核苷酸的IPC分离中,碱基位置对保留有一定的影响。处于末端的碱基贡献最大,其它位置碱基的贡献取决于其在空间结构中的位置。

      图2  初始有机溶剂强度和洗脱程序对19mer/20mer1(A)和20mer1/20mer2(B)分离的影响(略)

      Fig.2  Effect of initial organic strength and gradient program on separation of 19mer/20mer1(A) and 20mer1/20mer2(B)

      a. 13% B~25% B, 0.53% B/min; b. 12% B~25% B, 0.53% B/min; c. 11% B~25% B, 0.53% B/min; d. 12% B~25% B, 0.20% B/min; e. 12% B~25% B, 0.87% B/min; f. 11% B~25% B, 0.93% B/min; g. 13% B~25% B, 0.13% B/min。

      流动相(mobile phase)A: 0.05 mol/OL TEAA(acetic acid+triethylamine), 流动相(mobile phase)B: 100% ACN。柱温(temperature): 25 ℃; 其它条件同图1(other conditions are the same as shown in Fig.1)。 位置与固定相越接近,对保留的贡献越大。末端等优势位置随温度的改变,保留变化不大;中间等劣势位置容易受到温度的影响,产生较大的保留改变。

      3.2  流速的影响
       
      流速的影响实验在0.3~0.7 mL/min的条件下进行。实验结果显示,寡核苷酸的容量因子随流速的增加几乎线性下降,且在高流速下出现分离度增加的异常结果。为正确评价流速的影响,本实验以19mer/20mer1和20mer1/20mer2为研究对象,考察了流动相的初始洗脱强度和洗脱梯度对分离的影响,见图2。
       
      两组色谱图显示:12% B的初始强度下两组序列都获得较好分离,洗脱梯度的变化对分离度无明显的影响(见图2中b、d、e);但初始强度的微小改变却产生极大的分离差别(见图2中a和c),且这种影响无法通过洗脱程序的优化加以改善(见图2中f、g)。两组不同性质的样品受洗脱程序的影响并未呈现出样品的特异性。因此,在考察流速对寡聚核苷酸类样品分离度的影响趋势时,必须对不同流速下的洗脱程序进行调整,碱基组成相近、长度相似的寡核苷酸样品的洗脱程序可相互参考。
       
      图3  校正后流速对n/(n-1)(A)和n(B)系列寡核苷酸分离度的影响(略)

      Fig.3  Effect of flow rate after calibration on resolution of n/(n-1)(A) and n(B) oligonucleotides

      A1. 19mer/20mer1; A2. 20mer1/21mer; A3. 21mer/22mer; B1. 20mer1/20mer2; B2. 20mer1/20mer3; B3. 20mer2/20mer3。

      色谱条件同图2,洗脱梯度随流速的变化做相应调整(conditions are the same as shown in Fig.2, the elute program changed with the flow rate of mobile phase accordingly)。

      不同流速下的洗脱程序经校正后两系列样品的容量因子随流速增加而下降的趋势未变,但变化过程已明显不同于校正前的线性下降,且保留变化的差异明显大于校正前(图略)。图3A和图3B中两系列样品的分离度也反映出上述特点。除21mer/22mer外,其余5组样品均在0.4 mL/min的流速下实现了最大分离。继续增加流动相流速,分离度迅速下降。因此,相对较低的流速有利于n/(n-1)和n系列样品的分离,但如图3所示,过低的流速(0.3 mL/min)会使样品的纵向扩散增加,产生分离度下降。
       
      在不同长度寡核苷酸样品的分析中(见图3A),0.3 mL/min的分离结果与0.4 mL/min有较大差别,而同长异列样品在相同条件下分离度的差异明显小于基于长度差异的样品。这在一定程度上说明寡核苷酸样品的保留过程中,净电荷差异在流速的变化中对样品的保留有一定的影响。因此对不同长度寡核苷酸样品的分离应注重流速的优化。

    09-10-20 | 添加评论 | 打赏

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