蛋白检测方法

蛋白检测方法
09-11-02  匿名提问 发布
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    新华网北京7月30日奥运电(记者马向菲)北京奥运会兴奋剂检测方法是否严谨可靠对能否保证“干净、公平”的竞赛环境至关重要,负责奥运会兴奋剂检测工作的北京实验室负责人吴侔天30日说,检测方法是可靠的。

      最近有媒体报道,促红细胞生成素(EPO)的检测可能存在问题,一位科研人员说,他掌握的证据显示,一些EPO呈阳性的尿样却被国际药检机构宣布为阴性。专家称,这可能会对北京奥运会的兴奋剂检测形成挑战。

      同时身为中国反兴奋剂中心副主任的吴侔天对北京国际新闻中心集体采访的记者说,他注意到一些杂志对目前EPO的检测方法有讨论,很多兴奋剂检测的方法也在不断改进和完善过程中,但他相信EPO的检测方法是可靠的。

      “对于EPO的尿检我们是从2000年开始的,这么多年积累了很多经验。从目前全球的检测结果来看,EPO没有假阳性,”他说。

      新的检测方法也开始应用于北京奥运会。检测生长激素(HGH)的新方法已经得到世界反兴奋剂机构(WADA)批准,在北京奥运会开始使用。

      吴侔天说,负责北京奥运会兴奋剂检测工作的北京实验室7月份收到WADA的证书。新方法的主要优势是检测时限扩大。WADA总干事霍曼说过“新的检测时限已扩大到48小时以上”,但更具体的细节无法透露,以防“用药者有所防备”。

      吴侔天说,北京实验室为新方法的使用进行了一系列准备,包括引进设备,在5月将人员送到英国培训,并参加水平考试,也就是全球实验室之间的比对,取得了很好的成绩。

      EPO是上世纪80年代研制出来作为治疗肾病患者贫血症的用药,由于可以大幅提高运动员的携氧能力而被滥用。但它会引起红血球密度增加,增大了心脏病发作和中风的机会。

      HGH是一种由脑下垂体分泌,主控生长发育、免疫力和新陈代谢的重要荷尔蒙。它能够促进肌肉的生长,并加速脂肪的燃烧。滥用HGH将大大增加运动员患癌症、糖尿病和心脏病等的几率,并显著缩短寿命。

      北京奥运会的兴奋剂检查将是历届奥运会中最严的,检查数量从雅典奥运会的3600次增加到4500次,其中包括大约700至800次促红细胞生成素尿检和900次血检。

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    没有人学习啊

    一、实验目的与原理鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中,对胰蛋白酶有强烈的抑制作用,高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的,而在碱性溶液中较不稳定。由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用,因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基配制纯化胰酶的亲和材料。 二、材料与试剂: 1.材料:新鲜鸡蛋2只 2:仪器:抽滤瓶500-1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器 3:试剂: 10%TCA,用固体NaOH调调PH至1.05-1.10,需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M,PH8.0Tris-HCL缓冲液(每ml含0.34BAEE和 2.22mgCaCL2),50ml pH8.0,0.1M Tris-HCL缓冲液 三、操作步骤 1,取两只新鲜鸡蛋,得蛋清50ml,置于烧杯中,外用温水浴25℃-30℃,在不断搅拌条件下,缓慢加入等体积得三氯乙酸-丙酮(1:2V/V),立即出现大量白色絮状沉淀,加完后最终PH约3.5,再继续搅拌30min,然后在4℃冰箱中放置过夜。 2,次日用布氏漏斗抽滤,得黄绿色清液。 3,边搅拌边加入4℃预冷的丙酮200ml沉淀蛋白,在4℃放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收,下部沉淀部分于4000rpm离心5min,收集沉淀。 4,将沉淀溶于10ml无离子水中,对无离子水(50倍)透析4h,换水两次,再对碳酸钠缓冲液透析过夜,4000rpm离心10min ,去除不溶物一、实验目的与原理鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中,对胰蛋白酶有强烈的抑制作用,高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的,而在碱性溶液中较不稳定。由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用,因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基配制纯化胰酶的亲和材料。 二、材料与试剂: 1.材料:新鲜鸡蛋2只 2:仪器:抽滤瓶500-1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器 3:试剂: 10%TCA,用固体NaOH调调PH至1.05-1.10,需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M,PH8.0Tris-HCL缓冲液(每ml含0.34BAEE和 2.22mgCaCL2),50ml pH8.0,0.1M Tris-HCL缓冲液 三、操作步骤 1,取两只新鲜鸡蛋,得蛋清50ml,置于烧杯中,外用温水浴25℃-30℃,在不断搅拌条件下,缓慢加入等体积得三氯乙酸-丙酮(1:2V/V),立即出现大量白色絮状沉淀,加完后最终PH约3.5,再继续搅拌30min,然后在4℃冰箱中放置过夜。 2,次日用布氏漏斗抽滤,得黄绿色清液。 3,边搅拌边加入4℃预冷的丙酮200ml沉淀蛋白,在4℃放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收,下部沉淀部分于4000rpm离心5min,收集沉淀。 4,将沉淀溶于10ml无离子水中,对无离子水(50倍)透析4h,换水两次,再对碳酸钠缓冲液透析过夜,4000rpm离心10min ,去除不溶物

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    kkzfkk [小学生] 2009-6-29 19:51:16 211.157.183.* 举报
    蛋白质组蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出,指由一个基因组(genOME),或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(PROTein). 蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别,它随着组织、甚至环境状态的不同而改变. 在转录时,一个基因可以多种mRNA形式剪接,并且,同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰. 故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物,蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目. 蛋白质组学(Proteomics)处于早期“发育”状态,这个领域的专家否认它是单纯的方法学,就像基因组学一样,不是一个封闭的、概念化的稳定的知识体系,而是一个领域. 蛋白质组学集中于动态描述基因调节,对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定,鉴定疾病、药物对生命过程的影响,以及解释基因表达调控的机制. 作为一门科学,蛋白质组研究并非从零开始,它是已有20多年历史的蛋白质(多肽)谱和基因产物图谱技术的一种延伸. 多肽图谱依靠双向电泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和进一步的图象分析;而基因产物图谱依靠多种分离后的分析,如质谱技术、氨基酸组分分析等.
    [编辑本段]蛋白质组学的研究内容
    主要有两方面,一是结构蛋白质组学,二是功能蛋白质组学。其研究前沿大致分为三个方面:
    ① 针对有关基因组或转录组数据库的生物体或组织细胞,建立其蛋白质组或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群,即组成性蛋白质组学。
    ② 以重要生命过程或人类重大疾病为对象,进行重要生理病理体系或过程的局部蛋白质组或比较蛋白质组学。
    ③ 通过多种先进技术研究蛋白质之间的相互作用,绘制某个体系的蛋白,即相互作用蛋白质组学,又称为“细胞图谱”蛋白质组学。
    此外,随着蛋白质组学研究的深入,又出现了一些新的研究方向,如亚细胞蛋白质组学、定量蛋白质组学等。
    [编辑本段]蛋白质组学研究中的主要技术
    1 双向凝胶电泳技术(2-DE)
    双向凝胶电泳技术与质谱技术是目前应用最为广泛的研究蛋白质组学的方法。双向凝胶电泳技术利用蛋白质的等电点和分子量差别将各种蛋白质区分开来。虽然二维凝胶电泳难以辨别低丰度蛋白,对操作要求也较高,但其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点,使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段。双向凝胶电泳技术及质谱基础的蛋白质组学研究程序为样品制备→等电聚焦→聚丙烯酰胺凝胶电泳→凝胶染色→挖取感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白。蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率,同时也影响后续的质谱鉴定。蛋白质的染色可分为有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色四类。
    Unlu 等提出了一种荧光差异显示双向电泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白质组学分析方法。差异凝胶电泳(DIGE)是对2-DE 在技术上的改进,结合了多重荧光分析的方法,在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品,并第一次引入了内标的概念。两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合,进行2-DE,用来检测蛋白质在两种样品中表达情况,极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。在DIGE技术中,每个蛋白点都有它自己的内标,并且软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准,保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。DIGE 技术已经在各种样品中得到应用。
    2 高效液相色谱技术(HPLC)
    尽管二维凝胶电泳(2-DE)是目前常用的对全蛋白组的分析方法,但其存在分离能力有限、存在歧视效应、操作程序复杂等缺陷。对于分析动态范围大、低丰度以及疏水性蛋白质的研究往往很难得到满意的结果。Chong 等使用HPLC/ 质谱比较分析恶性肿瘤前和癌症两种蛋白质差异表达。利用HPLC 分离蛋白质,并用MALDI-TOF-MS 鉴定收集的组分,从而在两种细胞中的差异表达中对蛋白质进行定量分析。多维液相色谱作为一种新型分离技术,不存在相对分子质量和等电点的限制,通过不同模式的组合,消除了二维凝胶电泳的歧视效应,具有峰容量高、便于自动化等特点。二维离子交换- 反相色谱(2D-IEC-RPLC)是蛋白质组学研究中最常用的多维液相色谱分离系统。
    3 表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SEL-DI)技术
    表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱技术于2002 年由诺贝尔化学奖得主田中发明,刚刚产生便引起学术界的高度重视。SELDI 技术是目前蛋白质组学研究中比较理想的技术平台,其全称是表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDI-tof)。其方法主要如下:通常情况下将样品经过简单的预处理后直接滴加到表面经过特殊修饰的芯片上,既可比较两个样品之间的差异蛋白,也可获得样品的蛋白质总览。因此,在应用方面具有显著优势。 SELDI 技术分析的样品不需用液相色谱或气相色谱预先纯化,因此可用于分析复杂的生物样品。SELDI 技术可以分析疏水性蛋白质,PI 过高或过低的蛋白质以及低分子质量的蛋白质( < 25 000) ,还可以发现在未经处理的样品中许多被掩盖的低浓度蛋白质,增加发现生物标志物的机会。SELDI 技术只需少量样品,在较短时间内就可以得到结果,且试验重复性好,适合临床诊断及大规模筛选与疾病相关的生物标志物,特别是它可直接检测不经处理的尿液、血液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗出液、细胞裂解液和各种分泌物等, 从而可检测到样品中目标蛋白质的分子量、PI、糖基化位点、磷酸化位点等参数。
    4 同位素标记亲和标签(ICAT)技术
    同位素亲和标签技术是近年发展起来的一种用于蛋白质分离分析技术,此技术目前是蛋白质组研究技术中的核心技术之一。该技术用具有不同质量的同位素亲和标签( ICATs) 标记处于不同状态下的细胞中的半胱氨酸,利用串联质谱技术,对混合的样品进行质谱分析。来自两个样品中的同一类蛋白质会形成易于辨识比较的两个不同的峰形,能非常准确的比较出两份样品蛋白质表达水平的不同。ICAT 的好处在于它可以对混合样品直接测试;能够快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质,尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等;还可以快速找出重要功能蛋白质。
    由于采用了一种全新的ICAT 试剂,同时结合了液相色谱和串联质谱,因此不但明显弥补了双向电泳技术的不足,同时还使高通量、自动化蛋白质组分析更趋简单、准确和快速,代表着蛋白质组分析技术的主要发展方向。针对磷酸化蛋白分析以及与固相技术相结合ICAT 技术本身又取得了许多有意义的进展,已形成ICA T 系列技术。用具有不同质量的同位素亲和标签( ICATs) 标记处于不同状态下的细胞中的半胱氨酸,利用串联质谱技术,可对混合的样品进行质谱分析。
    5 生物信息学
    近年来,生物信息学在生命科学研究中起着越来越重要的作用。利用生物信息学对蛋白质组的各种数据进行处理和分析,也是蛋白质组研究的重要内容。生物信息学是蛋白质组学研究中不可缺少的一部分。生物信息学的发展,已不仅是单纯的对基因组、蛋白质组数据的分析,而且可以对已知的或新的基因产物进行全面分析。在蛋白质组数据库中储存了有机体、组织或细胞所表达的全部蛋白质信息,通过用鼠标点击双向凝胶电泳图谱上的蛋白质点就可获得
    如蛋白质鉴定结果、蛋白质的亚细胞定位、蛋白质在不同条件下的表达水平等信息。目前应用最普遍的数据库是NRDB 和dbEST 数据库。NRDB 由SWISS2PROT 和GENPETP 等几个数据库组成,dbEST是由美国国家生物技术信息中心(NCBI)和欧洲生物信息学研究所(EBI)共同编辑的核酸数据库;计算机分析软件主要有蛋白质双向电泳图谱分析软件、蛋白质鉴定软件、蛋白质结构和功能预测软件等。

    09-11-02 | 添加评论 | 打赏

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    前生如梦

    您好
    正常参考值:
    成年男性:30-400ng/ml
    成年女性:13-150ng/ml
    这只是正常参考值,每个医院都不完全一样,你要看你的检验结果后面的正常范围。
    正常情况下储存铁可用于血红蛋白的合成,低于12ng/ml,判断为潜伏期铁不足,

    09-11-30 | 添加评论 | 打赏

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